[Zohreh Gholami]

اصلاح برنج به روش کشت بساک

تک لادها  [wiki]Haploids[/wiki]اسپروفیت هایی با تعداد کروموزوم های گامتوفیتی هستند. آن ها با استفاده از کشت گامتوفیت های نر یا ماده در محیط های غذایی می توانند به وجود آیند. کشت بساک برنج برای تولید تک لادها به عنوان یک ابزار زادشناختی و اصلاح نژادی نیرومندی و به طور کلی در اصلاح گیاهان زراعی، جالب ترین پدیده ای است که در آزمایشگاه ابداع شده است. به ویژه هنگامی که این روش همراه با روش های دیگر اصلاح نژاد برای بروز نشانویژگی های مناسب در گیاهان زراعی به کار رود از اهمیت خاصی برخوردار خواهد گردید. اولین بار نی ای زیکی و اونو (1968) در ژاپن از کشت بساک برنج مفق به تولید گیاه تک لاد شدند. نی ای زیکی و هیر نیز بعدا از مدت کوتاهی گزارش دادند که گیاهان تک لاد به دلیل این که از دوبرابر شدن کروموزوم هایشان گیاهان دولاد  [wiki]Diploids[/wiki]و جور تخم  [wiki]Homozygous[/wiki]حاصل می شود، برای دانشمندان علم ژنتیک و اصلاح نبات اهمیت ویژه ای یافته است.

برنج اولین گیاه تک لپه ای است که از کشت بساک آن گیاه تک لپه ای تولید شده است. به هر حال پیش از آن کشت بساک گیاهان دو لپه‌ای نظیر تاتوره و توتون تحقق یافته بود. با این که، کشت بساک برنج در سال 1968 گزارش شد، اما تا نزدیک ده سال فعالیت چشمگیری وقوع نیافت تا این که در سال 1977 با ابداع ماهرانه محیط غذایی  N6 توسط چو و دیگر دانشمندان چینی فعالیت‌های جدیدی آغاز شد. از گزارش‌ها می‌توان چنین استنباط کرد که با گذشت 22 سال از آن، تحولات مهم و کوشش‌های توقف ناپذیری در کشت بافت برنج به ویژه کشت بساک آن ادامه دارد، اما هنوز به بسیاری از پرسش‌های آن پاسخ داده نشده است. این که چرا زیر گونه هندی نسبت به ژاپنی دارای قابلیت پنبه‌زایی و باززایی کمتری است؟ در مطالعات پیش دش ها protoplasts از قبیل تهیه پیش دش و همجوشی آن و انتقال ژن و DNA چرا زیرگونه هندی Indica نسبت به ژاپنی Japonica از بازدهی اندک‌تری برخوردار است؟

تولید یک لاین خالص برنج به روش مرسوم پدیگری به 10- 8 سال وقت نیازدارد و این روند، ازتلاقی والدین شروع می‌شود. نسل اول (F1) کاملا ناجور تخم اما از نظر زاد شناختی یکنواخت است. از تکثیر جنسی گیاهان نسل اول تفرق صفات شروع می‌شود. تفرق صفات عبارت است از جداسازی ژن‌ها و کروموزوم‌های همساخت از والدین مختلف در مرحله میوزی. در نسل دوم (F2) حداکثر تفرق صفات بروز می‌ یابد و در نسل پنجم (F5) گیاهان با 97% جور تخمی حاصل می‌شود. در حالی که برای گیاهان جور تخم از طریق کشت بساک تنها چند ماه زمان کافی است. از دو برابر کردن کروموزوم‌های گیاهان تک لاد، گیاهانی به دست می‌اید که به طور کامل جور تخم هستند و خالص می‌باشند (گامبورگ 1986)


اهداف
کشت بساک و ریزهاگ [wiki]Microspore[/wiki] یکی از راه‌های دستیابی به گیاهان تک لاد است که به طور وسیعی در اصلاح گیاهان زراعی به کار برده می شود. برتری و مزیت تولید تک لاد‌ها در برنج به منظور کوتاه کردن دوره اصلاح با پایداری جور تخمی، افزایش کارایی انتخاب، تغییر‌پذیری وسیع زاد شناختی از راه ایجاد متغییر‌های گامتوکلنی و پیگیری بروز سریع ژن‌های نهفته (مغلوب) هدف اساسی این گیاهان بسیار با اهمیت را تشکیل می‌دهد. از کشت بساک دو رگ‌های F1 در مدت زمان کوتاه‌تری می‌توان به ارقام خالص و پایدار دست‌یافت و به این ترتیب نیروی کار، زمان و فضای لازم و امکانات موجود را برای تولید لاین‌های خالص و پایدار و تثبیت یافته‌ای در مقایسه با روش‌های دیگر اصلاح نژاد می‌توان صرفه جویی کرد. علاوه براین از کشت بافت می توان در تولید سه لاین برنامه برنج دورگه استفاده کرد و نیز برای خالص سازی ارقام محلی که در اثر زراعت در مدت زمان طولانی ناخالص گردیده‌اند،سود برد.


عوامل مؤثر در بازدهی کشت بساک برنج
بازدهی کشت بساک و زیرهاگ برای تولید تک‌لاد‌ها به طور قابل ملاحظه‌ای متفاوت است و تاکنون سه عامل مؤثر: منابع گیاهی، تیمار فیزیکی و محیط غذایی به خوبی شناخته شده‌اند.
1- منابع گیاهی
در برنج پینه زایی و باززایی از بساک و ریزهاگ به زادمون ([wiki]Genotype[/wiki]) بستگی دارد و از ویژگی‌های وراثتی محسوب می گردد که توسط یک بسته منفردی از ژن‌ها هدایت می شود. عموماً برنج‌های زیرگونه هندی و دورگهایشان نسبت به ژاپنی با پینه زایی و باززایی گیاهی کمتر و زالی ([wiki]Albino[/wiki]) زیادتر مشخص می شود. به نظر می رسد فراوانی بازدهی کشت بساک و ریزهاگ برنج‌های ژاپنی مربوط به بزرگی دانه‌های گرده شان باشد که به زادمون و شرایط محیطی رشد گیاهان بستگی دارد. نسل اول تلاقی زادمون‌های حاصل از تلاقی‌های هندی×هندی، هندی× ژاپنی و ژاپنی× ژاپنی نسبت به والدینشان دارای توانایی پینه زایی، باززایی و تولید گیاهان سبز و زال متفاوتی هستند. تایچونگ و لاین 304 که دارای قابلیت پینه زایی و باززایی فراوان و سالاری کم بود، اما تلاقی نسل اول هر دو آن‌ها با سالاری متوسط  گردید. در بسیاری از موارد دو رگه‌های نسل اول نسبت به والدینشان القای پینه و باززایی بیشتر و تولید گیاهان زال فراوان‌تری را حایزاند. اخیراً نظراتی وجود دارد که نشان می دهد، القای پینه و باززایی توسط ژن‌هایی هدایت می شود که سیتوپلاسم فاقد آن‌ها است به هر حال عوامل سیتوپلاسمی را در فراوانی القای کشت بساک نمی توان بی تاثیر دانست.

شرایط رشد و حالت تنکار شناختی گیاه مادری به خوبی رابطه عوامل محیطی و زادشناختی در پاسخ بساک به کشت آزمایشگاهی آن تاثیر دارد. درجه حرات مرحله تشکیل جوانه زایشی بستگی به رقم و زادمون دارد، اما آنچه به نظر می رسد این است که در گلخانه در درجه حرارت زیاد خوشه‌هایی تشکیل می‌شود که با کاهش پینه‌زایی و باززایی و افزایش نسبت زالی‌ها مواجه خواهد گردید. فصل رویشی، دروه نوری، شدت نور، درجه حرارت محیط، رژیم‌های غذایی خاک نیز در بازدهی کشت بساک مؤثرند. لازم به توضیح است که در توتون بازده زیاد گیاهان هنگامی حاصل می شود که بساک‌ها در مرحله آغاز تکوین جوانه‌های گل جمع‌آوری شوند و در ضمن بالاترین سطح جنین‌زایی وقتی مشاهده می گردد که منابع گیاهی تحت شرایط روز کوتاه و با شدت نور زیاد رشد یابد.

مرحله تکوین ریزهاگ‌ها تاثیر وسیعی در پینه‌زایی دارد و بساک‌ها یا ریز‌هاگ‌های مرحله اواسط تا اواخر تک هسته‌ای مناسب‌ترین وضعیت را در کشت دارند. گرده برنج در مرحله نارس یا به طور کاملاًً رسیده پاسخ اندکی به کشت نشان می‌دهد. یا حتی پینه زایی ممکن است صورت نگیرد. مرحله‌ای که بساک‌ها بایستی تحریک شوند و سرمادهی در آن اجرا گردد، به طور مشخصی از زادمونی تبعیت می‌کند. تعداد 3 تا 4 شاخه اصلی هر بوته گیاه با فاصله 9- 5 سانتی‌متر برگ پرچم از برگ ما قبل آن تقریباً انتخاب صحیح مرحله تکوینی گرده را نشان می دهد. اما این فاصله در زادمون‌های گوناگون متغیر می‌باشد و علاوه بر تفاوت زاد شناختی نسبت به حالت‌های تنکار شناختی گیاهان مادری نیز بستگی دارد که این فاصله نیز به نوبه خود تحت تأثیر عواملی نظیر طول روز، شدت نور، درجه حرارت محیط رشد و مواد غذایی خاک و زمان کشت قرارمی گیرد.

برای بازدهی بیشتر پینه زایی و باززایی گیاهچه، از شاخه‌های قوی عاری از بیماری و آفات که هیچ گونه کمبود مواد غذایی نداشته باشند، استفاده می‌شود. ابتدا بذر‌های F1 یا ارقام مختلف را در صورتی که تازه برداشت شده یا محلی ایرانی باشد، مدت 5- 3 روز در آون C° 50 قرار می‌دهند تا دوره خواب آن‌ها شکسته شود. سپس آن‌ها را روی کاغذ صافی مرطوب داخل پتریدیش می‌ریزند و در دستگاه جوانه زنی (ژرمیناتور) سبز می کنند.پس از این که ریشه‌های بذور به اندازه یک سانتی متر رشد کرد، آن‌ها را به خاک جعبه کاشت در گلخانه یا فیتوترون انتقال می دهند و خاک آن را با آب کافی مرطوب می سازند. دوره نوری دستگاه فیتوترون 14 ساعت روشنایی با C° 29 و 10 ساعت تاریکی با C° 21 و رطوبت روی 80 الی 85 درصد تنظیم می شود. هنگامی که نشاءها به اندازه کافی رشد کردند، آن‌ها را به گلدان‌های محتوی خاک مرغوب مزرعه منتقل می سازند. از آنجا که گیاهان کاشته شده در مزرعه به کشت بساک بهتر پاسخ می‌دهند، در صورتی که شرایط آب و هوایی مناسب باشد، بایستی آن‌ها را به خاک مزرعه انتقال داد. گیاهانی که در گلخانه پرورش می یابند، قدرت القای پینه بساک و باززایی آن‌ها بسیار اندک است و در نتایج کار تحقیقاتی اثر نامطلوبی بر جای می گذارد. در مدت زمان رشد آن‌ها در داخل گلدان و در گلخانه، هیچ وقت نباید آب زیر بوته‌ها کم باشد. اگر گیاهان رشد خوبی نداشته باشند، بایستی مقادیر 2 گرم اوره ، 5/1 گرم فسفات آمونیوم و 75/1 گرم سولفات پتاسیم از انواع کودهای مورد استفاده در کشاورزی را به هر گلدان اضافه کرد.

2- تیمارهای فیزیکی
عوامل فیزیکی دارای دامنه تأثیر وسیعی در کشت بساک برنج است و شامل تیمارهای پیش از کشت و پس از کشت آن می باشد.

1-2- تیمارهای پیش از کشت
درصورتی که خوشه‌ها در معرض تیمارهای سرمایی یا گرمایی قرار گیرند، بساک هایشان در پینه زایی و باززایی، بازدهی خوبی از خود نشان خواهند داد. مدت زمان و درجه حرارت بهینه برای این تکانه حرارتی یک ویژگی زادشناختی است. تفاوت زیرگونه‌های برنج هندی و ژاپنی در نیاز به تیمار سرمایی هم به زادمون و هم به حالت تنکار شناختی آن‌ها بستگی دارد. در برنج تیمار سرمایی 8 درجه سانتی‌گراد به مدت 10- 8 روز، پینه زایی و تولید گیاهان تک لاد را به طور قابل ملاحظه‌ای افزایش داده است. مدت زمان بیش از 10- 8 روز تأثیر معکوسی در پینه زایی دارد. سرمادهی، تباهی دانه گرده نارس و بافت‌های دیواره بساک را به تأخیر می‌اندازد و نقش بسیار با اهمیتی در پینه زایی بساک برنج دارد. سرمادهی هم زمانی و زیستایی ریزهاگ‌ها را تشدید می‌نماید و آنزیم‌هایی را فعال می کند که در تولید پینه نقش ضروری را بازی می کنند تا به جنین تکوین یابند.  مدت زمان بهینه  پیش تیمار سرما با درجه حرارت آن (°C9-7) و مرحله تکوین ریزهاگ‌ها تغییر می کند. همانطور که توضیح داده شد، در برنج بالاترین فراوانی پینه از بساک هنگامی حاصل می شود که خوشه‌های قطع شده به مدت 10-8 روز در°C 8  تیمار شوند. علاوه بر این، گرمادهی خوشه‌ها به مدت 15-5 دقیقه در°C 35 پیش از تیمار سرما در یک رقم برنج به نام 42IR موجب افزایش بازدهی تشکیل پینه شده است (زاپاتا و توریزو، 1986). تکانه‌های سرمایی و گرمایی علاوه بر ایجاد همزمانی و زیستایی، آنزیم‌هایی ضروری برای القای پینه ریزهاگ‌ها به جای عمل زایشی، رشد و نمو اندام سبز را فعال می کند. این عمل می تواند موجب مخفی ماندن ژن‌ها یا فرآورده‌های آن‌ها یعنی آنزیم‌هایی شود که عهده‌دار نموگامتوفیتی اند تا ریزهاگ‌ها بتوانند در جهت نمو اسپوروفیتی تغییر یابند.

2-2- تیمارهای پس از کشت
نگهداری کشت‌ها به منظور پینه زایی و باززایی در درجه حرارت و دوره نوری معین بسیار با اهمیت می باشد، به طوری که با اندک تغییری در آن نتایج نامطلوبی حاصل می گردد. بنابراین دسترسی به اتاقک‌های درجه حرارت ثابت با دوره نوری و شدت نور قابل تنظیم از ضروریات حتمی است. بهترین درجه حرارت برای برای تشکیل پینه از بساک برنج 1±25 درجه سانتی گراد و برای نمایز یابی و تشکیل گیاه از پینه بساک 1±24 درجه سانتی گراد با دوره نوری 8 ساعت تاریکی و 16 ساعت روشنایی ( با شدت نوری 3500 لوکس ) است. درجه حرارت های بالاتر از آن میزان تولید گیاهان زال را افزایش و سبز را کاهش می دهد. به ویژه در درجه حرارت های بالاتر از 30 درجه سانتی گراد میزان تولید گیاهان زال به مقدار قابل توجهی زیاد می شود. ازاین گذشته، تراکم بساک ها و نیز طرز قرار گرفتن آن ها در محیط غذایی پینه زا، در بازدهی کشت تأثیر بسزایی دارد. علاوه براین، سن پینه در باززایی آن اثر می گذارد. از انتقال پینه هایی که 10 روز از تشکیل آن ها می گذشت به محیط های غذایی باززایی تقریبا 50 درصد آن ها گیاهچه  را تولید کردند. هنگامی که پینه های با سنّ 60 روزه به محیط های باززایی انتقال یافتند، همه گیاهچه های حاصل زال بودند و هیچ گونه گیاه سبزی به دست نیامد. به هرحال، پینه های مسن تر یا جوان تر و کوچک تر یا بزرگ تر، باززایی گیاهان را به اندازه قابل توجهی کاهش و پیدایش گیاهان زال را افزایش می دهد.

3 – محیط غذایی
محیط غذایی در تولید گیاهان تک لاد از راه کشت بساک و ریزهاگ اثر مهم و قاطعی دارد. نیازهای غذایی کشت با زادمون و احتمالا مرحله تکوینی بساک و شرایطی که تحت آن گیاهان مادری رشد می کنند، متفاوت است و اغلب گیاهان در یک محیط غذایی کامل ( نمک های معدنی، ویتامین ها و ساکارز) با مقادیر مختلف مواد تنظیم کننده رشد( هورمون ها) یا فاقد هورمون نر زایی دارند. با توجه به این که پیشرفت در در تولید گیاهان تک لاد تابعی از بازدهی کشت آن است، بهبود محیط های غذایی کشت همواره مورد نظر محققان بوده است.


نی ای زیکی و اونو (1968 ) برای اولین بار از کشت بساک برنج گیاه تک لاد را به وجود آوردند. آن ها در همان سال در مجله رسمی وزارت کشاورزی ژاپن ( جلد 3 شماره 3 سال 1968 ) این ر.یداد مهم را ثبت کردند. اما این روش به دلیل عدم وجود شرایط لازم به ویژه محیط غذایی مناسب نتوانست کارایی زیادی داشته باشد و استفاده از آن در اصلاح نژاد برنج عملا متوقف ماند. آن ها از یک محیط غذایی ساده ای استفاده کرده بودند که با محیط های غذایی تکامل یافته امروزی کوچک ترین شباهتی نداشت. چو و همکاران ( 1977 ) محیط غذایی N6  را که دارای بازدهی پینه زایی بیشتری است، در کشت بساک برنج و غلات دیگر رواج دادند و از این تاریخ عملاً تولید تک لادها برای اصلاح این غله مهم اقتصادی آغاز شد. علاوه بر این، چو (1978) یک محیط غذایی ساده محتوی 20درصد عصاره سیب زمینی را برای کشت بساک برنج پیشنهاد کرد. محیط غذایی سیب زمینی نسبت به MS نتیجه بهتری داشت. به هر حال کاربرد سیب زمینی به نوع و حالت تنکارشناختی آن نیز بستگی دارد. در حال حاضر، برای تولید پینه از بساک برنج، محیط های غذایی متعددی مورد استفاده قرار می گیرد که مهم ترین آن ها عبارتند از: Fj, L8, Ls, E10, B5, N6 و به ندرت MS . در میان این محیط های غذایی N6  رایج ترین کاربرد و به ویژه در کشت بساک برنج ارقام زیرگونه ژاپنی تأثیر بیش تری را نشان داده است. پینه زایی ارقام ایرانی نظیر عنبربو، حسنی و سیاه ریحانی که دارای قابلیت پینه زایی بسیار آلی هستند و تلاقی های آن ها با ارقام فاقد توانایی پینه زایی نظیر خزر، سپیدرود، نعمت و غریب در محیط های غذایی N6, L8, Fj نتایج رضایتبخش متفاوتی را نشان دادند. در رقم ایرانی عنبربو که دارای قابلیت پینه زایی بسیار عالی می باشد، در تلاقی با ارقام دیگر ایرانی که فاقد توانایی پینه زایی، نتنها توانایی پینه زایی را در آن ها بالا برد بلکه میزان تولید گیاهان باززایی را نیز به اندازه کافی افزایش داد ( 1377 ). به هر حال، بازدهی اندک کشت بساک برنج زیرگونه هندی در محیط های غذایی  Fj, L8, N6  همواره یک مشکل بسیار مهمی بوده است. N6  در القاء پینه از خوشه های نارس برنج نیز تأثیر دارد و با تغییر هورمون های آن، در تمایز یابی نیز مورد استفاده قرار می گیرد.

منابع نیتروژن معدنی مانند NO3 و NH4 و مواد آلی مانند: گلوتامین، اسید گلوتامیک، آلانین، کازئین هیدرولیزات، گلوتاتیون و آسپاراژین از مهم ترین نشانویژگی های محیط های کشت بساک برنج هستند. یون آمونیوم در القاء پینه از دانه گرده نارس بسیار حساس و با اهمیت است، به طوری که مقادیر پایین آن پینه زایی را افزایش، اما مقادیر زیادتر، آن را متوقف می سازد. به همین جهت نسبت نیتروژن نیتراتی به آمونیومی در محیط های غذایی  Fj, MS, Ls, B5, N6 با دقت خاصّی تنظیم یافته که کارایی آن را در سطح وسیعی موجب شده است. از تغییر این محیط های غذایی، محیط های دیگری فراهم گردیده اند که عبارتند از: He3 از N6 توسط هانگ در سال 1981 و E10 از B5 توسط زاپاتا و توریزو در سال 1985. استفاده از مقادیر نیتروژن نیتراتی بیش تر از آمونیومی آن توصیه شده است. اما وقتی نیترات با ترکیب غیر آمونیومی در محیط های غذایی استفاده شود، به مرورزمان pH محیط غذایی بالا خواهد رفت و جذب مواد غذایی دیگر به ویژه یون Fe اختلال ایجاد می شود.

منابع کربن در محیط غذایی هم انرژی لازم را تأمین می کند و هم پتانسیل اسمزی را افزایش می دهد. بافت هایی که در محیط کشت به تدریج بزرگ می شوند و در محیط های مصنوعی و غیر طبیعی رشد کرده اند، نسبت به کربن خود غذا ( اتوتروف ) نیستند بلکه بایستی کربن مورد نیاز خود را از یک منبع خارجی جذب کنند. ساکارز یک منبع مؤثر کربوهیدرات محسوب می شود که غلظت آن در القای گیاهان گرده ای نقش بسیار با اهمیتی برعهده دارد. غلظت ساکارز در پینه زایی از بساک برنج و باززایی آن 5 – 2 درصد است.